图1 氟虫腈及3 种代谢物结构式
Fig.1 Structures of fipronil and its three metabolites
氟虫腈商品名为锐劲特，是法国Rhone-Poulenc公司开发的世界上首个苯基吡唑类杀虫剂[1]，主要作用是通过与α-氨基丁酸受体结合，抑制氯离子通道，破坏中枢神经系统从而杀灭昆虫[2]。氟虫腈杀虫谱广，具有触杀、胃毒和中毒内吸作用，与现有的杀虫剂无交互抗性，对已产生常规杀虫剂抗性的害虫有较好的防治效果，可适用于水稻、玉米、棉花及其他广泛经济作物的虫害防治中[3-4]。氟虫腈自推出伊始，就被众多农药专家推荐为代替高毒有机磷农药的选择之一，成为农药界追捧的热点[5]。但随着使用的推广，关于氟虫腈及其在农产品中代谢产物的研究也越发深入，涉及到了剂量评估、毒性监测及环境友好度评价等多方面[6-8]。氟虫腈是一种化学性质活泼的化合物，在施用后，经过水解、光解等作用，会生成3 种代谢产物氟虫腈砜（MB46136）、氟虫腈硫醚（MB45950）和氟甲腈（MB46513）[9]。而经过对代谢物毒性的研究，这三者的毒性要高于氟虫腈原药[10]，氟虫腈被世界卫生组织列为“对人类有中等毒性”的化学品。
鉴于氟虫腈对甲壳类水生生物和蜜蜂具有高风险，在环境中降解慢，在保护环境的大背景下，我国农业部于2009年发布公告停止生产销售氟虫腈农药[11]。同时在GB 2763—2016 《食品中农药最大残留限量》中，对植物源性食品中氟虫腈残留量进行了严格的限定[12]。国外方面，欧盟做出规定氟虫腈不得用于人类食品产业链的畜禽养殖过程，也做出了食品中氟虫腈限量的详细规定，包括动物源性食品鸡蛋和鸡肉中0.005 mg/kg的最大允许残留量[13]。但是近年来发现偶有因农药隐性添加而导致氟虫腈阳性检出的情况，而荷兰、德国等欧洲16 国及韩国等地更是爆出了大规模的氟虫腈污染鸡蛋的食品安全事件，并造成了广泛的恶劣影响[14]。
目前，测定食品中氟虫腈的测定方法主要有气相色谱法[15-16]、气相色谱-质谱联用法[17-19]、液相色谱-质谱联用法[20-23]等。GB 2763—2016中规定，氟虫腈的残留标志物为氟虫腈、MB46513、MB46136、MB45950之和；欧盟规定残留标志物为氟虫腈和MB46136之和，均涉及到氟虫腈代谢物的含量测定。而目前的标准方法和报道文献方法中大多集中在原药的测定上，仅有极少部分对氟虫腈代谢物的测定进行方法研究。Cheng Youpu等[24]使用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）-超高效液相色谱-串联质谱联用法对氟虫腈原药及3 种代谢物进行测定，周昱等[25]使用固相微萃取-气相色谱和气相色谱-质谱联用法对原药和4 种代谢物进行测定，但以上这些研究均应用于蔬果茶叶中，目前鲜见动物源性食品中氟虫腈及其代谢物的测定方法有报道。
图1 氟虫腈及3 种代谢物结构式
Fig.1 Structures of fipronil and its three metabolites
本实验运用QuEChERS法结合超高效液相色谱-串联质谱法，对鸡蛋、鸡肉等动物源性食品基质中氟虫腈以及MB46513、MB46136、MB45950等代谢物的测定进行研究。与常规方法相比，本方法提高了检测效率，扩大了适用范围，并能够监测法规所要求的全部残留标志物的含量。经方法验证，方法灵敏度、精密度和检出限均符合残留分析的要求。
鸡蛋、鸡肉 市购。
氟虫腈、氟虫腈砜（MB46136）、氟虫腈硫醚（MB45950）、氟甲腈（MB46513） 德国Dr. E公司；甲醇、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯） 美国Fisher公司；乙腈、无水硫酸镁、氯化钠、二水合柠檬酸钠、三水合二柠檬酸氢二钠（均为分析纯） 北京化学试剂厂；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL/200 mg）美国Waters公司；实验用水为Milli-Q制备的超纯水。
UPLC-TQ-S超高效液相色谱-串联质谱联用仪（配有电喷雾离子源及Masslynx 4.1 SCN 803软件） 美国Waters公司；X1R高速冷冻离心机 美国Thermo公司；Milli-Q纯水仪 美国Merck-Millipore公司。
1.3.1 标准溶液的配制
准确称取各标准品于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解，定容至刻度，配制成1 000 μg/mL的标准储备液，转入棕色瓶中置于－20 ℃环境中保存。根据实验需要用乙腈稀释成混合标准工作液。
1.3.2 超高效液相色谱条件
色谱柱：Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速 0.4 mL/min；柱温 35 ℃；流动相：A为甲醇，B为5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）； 梯度洗脱条件：0～0.5 min 50%～70% A，0.5～3.0 min 70% A，3.0～3.5 min 70%～99% A，3.5～4.5 min 99% A，4.5～5.0 min 99%～50% A，5.0～6.0 min 50% A；进样量2 μL。
1.3.3 质谱条件
电喷雾电离源；负离子模式电离；多反应监测方式检测；毛细管电压1.00 kV；离子源温度150 ℃；锥孔气流量150 L/h；脱溶剂气温度450 ℃；脱溶剂气流量900 L/h。氟虫腈及其代谢物的色谱-质谱参数见表1。
表1 氟虫腈及其代谢物色谱-质谱参数
Table1 Chromatographic and MS parameters for fipronil and its metabolites
注：*.定量离子。
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1.3.4 样品预处理
鸡蛋取内容物，充分打散后，10 000 r/min均质1 min。鸡肉样品搅碎后，10 000 r/min均质1 min。取2 g经充分均质的样品于50 mL旋盖离心管中，加入10 mL水充分涡旋进行分散后，加入10 mL乙腈，混匀后超声提取30 min，随后加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g三水合二柠檬酸氢二钠，剧烈振摇1 min，于4 ℃、10 000 r/min离心4 min。取0.5 mL乙腈层和0.5 mL水充分混匀后过0.22 μm滤膜，上机测定。
定性方法：按照超高效液相色谱-串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中氟虫腈及代谢物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准工作溶液中相应成分的相对丰度。当实验中检出与标准品的色谱保留时间一致的色谱峰，并且相对离子丰度允许偏差不超过GB/T 27404—2008中的规定范围，可以确定试样中检出相应氟虫腈或其代谢物。
定量方法：以基质加标标准曲线的系列质量浓度为横坐标，相应样品在仪器中各化合物色谱峰响应峰面积为纵坐标，做回归曲线。试样中定性检出目标化合物时，将对应色谱峰的响应峰面积代入回归曲线方程中，计算得到试样中该化合物的质量浓度。
2.1.1 质谱参数的优化
分别配制30 ng/mL的各化合物标准品，使用电喷雾质谱用蠕动泵持续进样，与适当流速的流动相混合后注入质谱，对氟虫腈及代谢物分别进行质谱参数的确定。由于氟虫腈及代谢物结构中含有较多卤代基，在离子源内易形成负离子，且响应强度较好。因此选择较低的毛细管电压，以降低基质杂质可能带来的干扰。优化锥孔电压使得母离子丰度最大且稳定，开启碰撞气后，优化碰撞能量，选取响应丰度较高、易得到、出峰稳定的几个碎片离子作为子离子。再通过配制空白鸡蛋基质标准溶液，排除易受基质干扰的碎片，得到2 对监测离子对，选择响应丰度较高、干扰较少的作为定量离子对。
2.1.2 分离条件的选择
氟虫腈与其代谢物的化学结构极为接近，且极性均偏弱，在参考已报道的文献资料[26-29]的基础上，因此选择BEH C18色谱柱作为分离介质。对比使用不同流动相配比及梯度设置时，4 个化合物的保留时间和分离度参数。分别对比使用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液、甲醇-水、甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）等流动相体系。保留时间结果如表2所示。可以看到使用甲醇-酸化缓冲液的体系时，4 个化合物的色谱行为有分离的趋势。调整洗脱梯度条件，使4个化合物能够达到基线分离，获得合适的色谱分离条件。图1为空白鸡蛋基质提取液添加1 ng/mL标准品所得的总离子流图。
表2 不同流动相组成下各化合物保留时间
Table2 Retention times for the analytes under different mobile phase compositions
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图1 优化条件下的色谱分离图
Fig.1 Chromatographic separation under optimized conditions
2.2.1 提取条件的选择
氟虫腈属于中等偏弱极性化合物，在提取过程中易溶解于有机试剂中。QuEChERS法[30]自发明以来，经不断发展，已成为农药残留分析的首选方法，但QuEChERS推荐方法均主要用于分析植物源性食品，因此，本实验对用QuEChERS法提取鸡蛋等动物源性食品中氟虫腈农药的条件进行比较优化。
实验对比使用乙腈或甲醇直接提取，以及使用QuEChERS法结合不同除水分散剂进行萃取的提取效率。制作添加量为2 μg/kg的加标样品，平行按下列方法分别提取：方法1：加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈溶液提取；方法2：加入 10 mL乙腈提取；方法3：先加入10 mL水进行分散后，加入10 mL乙腈提取，使用5 g NaCl除水；方法4：按AOAC法，先加入10 mL水进行分散后，加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈提取后，使用4 g MgSO4+1 g NaCl除水；方法5：按CEN法，先加入10 mL水进行分散后，加入10 mL乙腈提取，加入除水缓冲盐（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3Cit+0.5 g 2Na2HCit·1.5H2O），所得的提取液不经净化直接上机测定。4种化合物的回收率对比如图2所示。
图2 不同提取条件下各化合物提取效率的对比
Fig.2 Comparison of analyte recoveries using different extraction methods
从图2可以看出，使用QuEChERS法结合柠檬酸缓冲盐体系的提取效率最佳，这可能是因为QuEChERS法对样品的分散较好，另外，加入缓冲盐能够更加促进盐析过程，使化合物分配向有机相移动，从而提高了提取效率。
2.2.2 净化条件的选择
鸡蛋和鸡肉等动物源性食品，主要含有大量脂肪、蛋白质以及部分脂溶性基质杂质。通过基质分散乙腈提取，可以除去蛋白质的影响，冷冻离心过程可以去除脂肪的影响。针对其余痕量杂质的影响和去除手段，实验考察Waters Oasis PRiME HLB、Agilent EMR、Dikma ProElut PLS等净化方式，取2 mL提取液通过PRiME柱和PLS柱，接收馏出液；取2 mL提取液与50 mg EMR混匀1 min。分别取0.5 mL净化液于0.5 mL水混合后上机测定。从图3可以看出，各净化手段对目标化合物的回收率均无明显影响，同时对比净化前后的谱图，未见有显著杂峰对目标物有影响。采用基质添加样品（2 μg/kg），连续进样后，未见响应有明显变化，因此，采用不净化的方式，对提取液进行适当稀释，并在满足检出限的前提下降低进样量，以达到消除基质干扰的目的。
图3 不同净化条件下各化合物回收率对比
Fig.3 Comparison of analyte recoveries using different clean-up methods
2.3.1 基质效应
使用空白鸡蛋和鸡肉基质，进行样品前处理、得到空白基质溶液。使用空白基质溶液分别配制质量浓度为0.5、1、2、10、20、50 ng/mL的系列基质配制标准曲线和溶液标准曲线。按如下公式计算评价基质对各化合物的基质效应[31]：
式中：ME为基质效应；A为溶液标准曲线的斜率；B为基质匹配标准曲线的斜率。
若ME＜1，则表现为基质抑制效应，ME＞1，则为基质增强效应。由表3可知，氟虫腈在鸡肉中有基质抑制效应，氟虫腈砜在鸡蛋中有增强效应，其余基质效应不明显，在测定中可选择基质加标标准曲线法定量。
表3 鸡蛋和鸡肉中各化合物的基质效应
Table3 Matrix effects of chicken eggs and meat
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2.3.2 线性及灵敏度检测结果
取空白样品，制作分别为1、2、5、10、20 μg/kg的基质加标系列样品，在上述条件下，各化合物的定量离子均能达到信噪比大于10 倍，参考欧盟有关氟虫腈及其代谢物在鸡蛋和鸡肉中的限量值为5 μg/kg[13]，且GB 2763—2016中规定其残留标志物为4 种化合物之和[12]，因此，将4 种化合物的定量限均定为1 μg/kg，检出限为0.5 μg/kg。线性方程、决定系数、线性范围、检出限及定量限见表4。各化合物在1～100 μg/kg的范围内线性关系良好。
表4 氟虫腈及代谢物的线性方程、决定系数、线性范围、检出限、定量限、平均回收率（n= 6）及精密度数据
Table4 Calibration equations, coefficients of determination, liner ranges, LODs, LOQs, average recoveries and precision (RSD, n = 6) for fipronil and metabolites
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2.3.3 回收率和精密度实验结果
取空白鸡蛋和鸡肉样品，添加混合标准溶液后混合均匀，得到质量浓度分别为1（定量限）、5（限量值）、10 μg/kg（两倍限量值）3 个水平的基质加标样品，在优化后的条件下测定目标化合物。每个水平平行测定6 次，如表4可知，使用所建立的方法定量测定氟虫腈及代谢物，在鸡蛋中平均回收率为93.6%～117.7%，相对标准偏差为8.5%～9.9%，在鸡肉中平均回收率为87.6%～106.3%，相对标准偏差为3.6%～8.2%，参考GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》附录F方法确认的技术要求中的相关内容[32]，该方法满足残留检测的要求。
随机抽取市售鸡蛋15 个、鸡肉10 个。应用建立的方法对样品进行测定，结果如图4所示，在某一鸡蛋样品中检出氟虫腈砜30.7 μg/kg。
图4 鸡蛋空白样品和阳性样品的定量离子提取离子流图
Fig.4 Quantitative extracted ion chromatograms of standard, blank and positive samples
本研究采用QuEChERS法提取，超高效液相色谱分离，串联质谱法检测，建立鸡蛋、鸡肉中及其3 种代谢物的同步测定方法。与标准方法及已有报道相比，本方法涵盖了GB 2763—2016及欧盟限量规定中的氟虫腈的全部残留标志物检测，并通过色谱条件优化，稀释进样等手段，降低了基质干扰，简化了前处理耗时，达到了快速、准确、可靠的测定，为开展动物源性食品中相关农药残留测定进行探索。经方法学验证，该方法回收率、精密度、线性、测定低限等均满足残留检测方法确认的要求，适用于鸡蛋、鸡肉中氟虫腈及代谢物的快速定量测定。
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Determination of Fipronil and Its Metabolites Residues in Chicken Meat and Eggs by QuEChERS-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry